La fine dell’Impero Romano d’Occidente, culminata ufficialmente nel 476 d.C. con la deposizione di Romolo Augustolo da parte di Odoacre, rappresentò per Tivoli il compimento di un lungo processo di decadenza e trasformazione. Già a partire dal III secolo d.C., il territorio tiburtino aveva manifestato i segni di una crisi profonda, caratterizzata dalla contrazione delle piccole proprietà a favore del latifondo e dalla progressiva mancanza di manutenzione delle vitali opere idrauliche.
Durante il V secolo, Tivoli subì direttamente il trauma delle invasioni barbariche: nel 435 d.C., le orde dei Vandali guidate da Genserico danneggiarono gravemente il territorio e l'economia agricola locale. In questo clima di estrema instabilità si inserì la figura del tiburtino Papa Simplicio (468-483), eletto al soglio pontificio proprio mentre l'autorità imperiale spirava definitivamente. Simplicio giocò un ruolo chiave nella transizione, promuovendo l'ascesa politica della Chiesa sulle rovine dell'impero e avviando a Tivoli la costruzione di importanti edifici di culto, come San Silvestro, San Pietro alla Carità e Santa Maria Maggiore, quest'ultima edificata riutilizzando i resti di una villa romana.
Tuttavia, il vero spartiacque tra l'antichità e il Medioevo per Tivoli fu la guerra greco-gotica (535-553 d.C.). Nel 544 d.C., la città fu espugnata dal re goto Totila grazie al tradimento di alcuni cittadini; ne seguì un massacro orrendo della popolazione che non risparmiò donne e fanciulli e vide l'uccisione del vescovo della città. Totila, riconoscendo il valore strategico di Tivoli per il controllo della via Valeria, fece in seguito ricostruire le fortificazioni, trasformando definitivamente la città in un "Castello" o fortezza militare.
Questa fase di insicurezza portò a una drastica contrazione urbana: l'abitato si restrinse all'interno della cinta muraria repubblicana, abbandonando le zone di espansione imperiale che erano diventate impossibili da difendere. I monumenti classici e le gloriose ville romane, ormai in rovina, iniziarono a essere utilizzati come cave di materiale: pietre, marmi e colonne vennero sistematicamente asportati per costruire le nuove chiese e i palazzi della città medievale, segnando il passaggio definitivo da un centro di villeggiatura imperiale a un presidio arroccato sui colli.